非洲豬瘟(wēn)熒光(guāng)定(dìng)量(liáng)PCR儀(yí)標準(zhǔn)化操(cāo)作流程(chéng)

　　一，實(shí)驗(yàn)前準備(bèi)

　　1.設備預(yù)熱：

　　開啟(qǐ)非洲豬(zhū)瘟熒光(guāng)定量(liáng)pcr儀，選(xuǎn)擇(zé)預運行(háng)程(chéng)序進行(háng)係(xì)統預(yù)熱，建議預(yù)熱時間(jiān)≥30分鐘(zhōng)。檢查(chá)各溫(wēn)控模塊(kuài)性(xìng)能，確保溫度波動≤±0.5℃（95℃測試點）。

　　2.樣本(běn)處(chǔ)理：

　　核酸提(tí)取：采(cǎi)用商品化核酸提(tí)取試劑盒，按(àn)說明(míng)書(shū)操作獲(huò)取DNA模板(bǎn)。提取(qǔ)後的核(hé)酸(suān)需在2小(xiǎo)時內完成(chéng)檢測，-20℃保(bǎo)存不(bù)得超過(guò)7日。

　　試(shì)劑準(zhǔn)備：配製(zhì)反應體係（20μL體係(xì)）：

　　（1）2×熒(yíng)光PCR反(fǎn)應(yīng)液(yè) 10μL

　　（2）引物(wù)探針混合液 1μL

　　（3）酶(méi)混合物 0.5μL

　　（4）模板(bǎn)DNA 5μL（濃度50-100ng/μL）

　　（5）滅菌ddH₂O 3.5μL

　　配置好的反應體(tǐ)係於冰(bīng)上保存備(bèi)用，避免(miǎn)反(fǎn)復凍融。

　　二(èr)，實驗(yàn)操作規(guī)程(chéng)

　　1.上機(jī)設置

　　選擇(zé)ASFV專(zhuān)用(yòng)檢測程(chéng)序(xù)：

　　（1）預變性(xìng)：95℃ 30s

　　（2）循環擴增（40 cycles）：

　　①變(biàn)性(xìng)：95℃ 5s

　　②退(tuì)火/延(yán)伸：60℃ 30s

　　③熒光采(cǎi)集(jí)：FAM通道(dào)（探(tàn)針檢測）

　　2.樣本(běn)裝(zhuāng)載(zǎi)

　　將配置(zhì)好(hǎo)的反應管(guǎn)裝入加熱模(mó)塊，確認：

　　（1）管蓋(gài)密封完(wán)好

　　（2）試(shì)管無氣(qì)泡(pào)殘(cán)留

　　（3）樣本(běn)編號(hào)與軟件對應

　　設(shè)置陰性對(duì)照（N/C），陽性對(duì)照(zhào)（P/C）和(hé)標(biāo)準品，建議每(měi)板設置(zhì)3個N/C。

　　3.儀器(qì)運行：啟動(dòng)PCR程序，實(shí)時監(jiān)控擴增(zēng)曲(qū)綫(xiàn)。正(zhèng)常狀態下(xià)，陰(yīn)性(xìng)對照(zhào)應(yīng)無S型擴(kuò)增(zēng)，陽性(xìng)對(duì)照(zhào)CT值(zhí)應(yīng)在18-25之間。

　　三(sān)，結果(guǒ)分析與報(bào)告

　　1.數據(jù)分(fēn)析

　　CT值判(pàn)定標準(zhǔn)：

　　（1）CT≤30且呈現(xiàn)典(diǎn)型S型曲綫為(wéi)陽(yáng)性

　　（2）CT＞35或無擴增(zēng)曲(qū)綫為陰(yīn)性

　　（3）30＜CT≤35需重(zhòng)復(fù)驗證

　　FAM通(tōng)道Ct值≤閾(yù)值（可參(cān)照試劑盒(hé)要(yào)求）判定(dìng)為ASFV核酸陽性(xìng)。

　　2.報(bào)告生成(chéng)

　　報告(gào)內(nèi)容應包含：

　　（1）樣本(běn)編(biān)號(hào)及(jí)來源；

　　（2）CT值(zhí)及擴(kuò)增(zēng)曲綫圖；

　　（3）陽(yáng)性/陰性(xìng)判(pàn)定結果(guǒ)；

　　（4）檢(jiǎn)測及(jí)復(fù)核人(rén)員簽(qiān)名(míng)；

　　（5）檢(jiǎn)測(cè)日(rì)期(qī)及(jí)實驗室(shì)信息(xī)；

　　3.廢(fèi)棄處(chǔ)理：實(shí)驗結束後(hòu)，生物危害廢棄(qì)物(wù)需按規程(chéng)處理(lǐ)，反(fǎn)應管(guǎn)置(zhì)於專用(yòng)廢料桶(tǒng)中(zhōng)。
 

　　四，非(fēi)洲豬瘟(wēn)熒光定量(liáng)pcr儀(yí)注(zhù)意(yì)事(shì)項

　　1.操作全程(chéng)必須穿戴(dài)防護服(fú)和(hé)手套(tào)；

　　2.每批(pī)次實(shí)驗需(xū)同(tóng)時(shí)設(shè)立陰(yīn)，陽(yáng)性(xìng)對照；

　　3.儀(yí)器表(biǎo)麵每日使(shǐ)用(yòng)75%乙(yǐ)醇(chún)消毒；

　　4.建(jiàn)議(yì)每月(yuè)使用(yòng)標(biāo)準物(wù)質(zhì)進(jìn)行儀器校準；

　　5.當檢測結果異(yì)常時(shí)，必須進(jìn)行復檢確(què)認(rèn)。

　　本(běn)操(cāo)作流(liú)程(chéng)嚴(yán)格遵循GB/T 40947-2021《非洲豬瘟(wēn)診斷(duàn)技術》國家標準，規(guī)範化的操作可有效預防交(jiāo)叉汙(wū)染(rǎn)，確(què)保檢測結(jié)果(guǒ)的(dí)準(zhǔn)確性和(hé)重(zhòng)復(fù)性(xìng)。實(shí)驗室需(xū)建(jiàn)立完(wán)整的(dí)質(zhì)量控(kòng)製體(tǐ)係，定期對(duì)操作人(rén)員(yuán)進行專業培(péi)訓，為非洲(zhōu)豬瘟防控工作(zuò)提供(gōng)科學依據。